A partire dal 1560 l'edificio delle Magistrature, originaria denominazione del complesso, iniziò ad essere costruito, comportando delle demolizioni.
Questo problema fu in parte risolto da Vasari che penso di occupare meno spazio ma adottare soluzioni di grande impatto scenografico.
Al piano terreno furono trasferite le 13 Magistrature che governavano la produzione e il commercio fiorentino, al primo piano erano collocati gli uffici amministrativi e gli opifici granducali.
Il Granduca Francesco I allestì per primo, con le sembianze di un museo, la galleria posta all'ultimo piano del complesso.
Nell'ala orientale del palazzo fu costruito il Teatro Mediceo, inaugurato nel 1588,che era la sede del Senato negli anni in cui Firenze fu capitale del Regno d'Italia, nel 1889 venne sezionato in due volumi per ricavarne ambienti espositivi.
Nel 1956 ci fu un riallestimento delle prime sale della Galleria e il 17 dicembre 2011 venne inaugurata la nuova scala di ponente che consente il collegamento del piano storico della Galleria ai nuovi ambienti del primo piano.